藥物誘導(dǎo)基因敲除實(shí)驗(yàn)

一、藥物誘導(dǎo)基因敲除實(shí)驗(yàn)核心系統(tǒng)及原理

1. 他mo昔芬（Tamoxifen）誘導(dǎo)系統(tǒng)

• 時(shí)間可控性強(qiáng)，避免胚胎期致死問題；

• 高靈敏度版本（如Cre-ERT2）對4-OHT的敏感性提升10倍。

• 原理：將Cre重組酶與突變型雌激素受體（ER-LBD）融合形成Cre-ER(Tam)融合蛋白。未給藥時(shí)，該蛋白與熱休克蛋白（HSP90）結(jié)合并滯留于細(xì)胞質(zhì)；給藥后，他mo昔芬與ER結(jié)合，釋放Cre進(jìn)入細(xì)胞核，介導(dǎo)loxP位點(diǎn)間的重組。

• 優(yōu)勢：

2. 四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)（Tet-On/Tet-Off）

• Tet-Off系統(tǒng)：無需四環(huán)素時(shí)，tTA蛋白激活Cre表達(dá)；給予多xi環(huán)素（Dox）則抑制Cre活性，適用于持續(xù)敲除場景。

• Tet-On系統(tǒng)：需Dox激活rtTA蛋白才能啟動Cre表達(dá)，適用于短期誘導(dǎo)。

• 應(yīng)用：常用于發(fā)育階段特異性基因功能研究，如肺上皮細(xì)胞基因敲除。

3. 干擾素誘導(dǎo)系統(tǒng)（Mx1-Cre）

• 通過注射polyI:C或干擾素誘導(dǎo)Cre表達(dá)，適用于免疫細(xì)胞或肝臟等干擾素響應(yīng)組織的研究。

二、藥物誘導(dǎo)基因敲除實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程

1. 構(gòu)建Flox小鼠：在目標(biāo)基因兩側(cè)插入loxP序列，確?；蛘９δ懿皇苡绊?。

2. 選擇Cre工具鼠：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇組織特異性或藥物誘導(dǎo)型Cre品系（如Alb-CreERT2用于肝臟特異性敲除）。

3. 藥物處理：

• 他mo昔芬：成年小鼠連續(xù)5天腹腔注射（75-100 mg/kg），溶解于玉米油或葵花籽油。

• 多xi環(huán)素：通過含藥飼料（600 mg/kg）連續(xù)喂養(yǎng)14天。

4. 表型分析與驗(yàn)證：通過PCR、Western blot或熒光報(bào)告系統(tǒng)確認(rèn)敲除效率。

三、應(yīng)用場景

1. 疾病模型構(gòu)建：如腫瘤研究中誘導(dǎo)性敲除致癌基因，觀察腫瘤發(fā)生動態(tài)。

2. 發(fā)育生物學(xué)：研究特定發(fā)育階段（如胚胎期或成年期）基因功能。

3. 組織特異性研究：結(jié)合組織特異性啟動子（如神經(jīng)元Nestin啟動子），解析基因在特定細(xì)胞類型中的作用。

四、注意事項(xiàng)

1. 藥物交叉污染：處理組與對照組需分籠飼養(yǎng)，避免他mo昔芬通過糞便交叉誘導(dǎo)。

2. 脫靶效應(yīng)：部分Cre品系存在本底活性（如Cre-ERT2的泄露表達(dá)），需設(shè)置嚴(yán)格對照。

3. 劑量優(yōu)化：藥物濃度和給藥頻率需根據(jù)動物年齡、品系調(diào)整，避免毒性。